پایان نامه روشهای ویروس شناسی تخم مرغ جنین دار، کشت سلول، Elisa، HI، PCR

مقدمه:

یکی از شاخصه های مهم درمان تشخیص صحیح و سریع عامل عفونی می باشد.

هم اکنون علم تشخیص جایگاه رفیعی در علم پزشکی پیدا کرده و سالیانه میلیاردها دلار سرمایه در جهت پیشرفت این علم هزینه می‌شود.

در بیماریهای عفونی دستیابی به تشخیص صحیح باعث می‌شود که درمان توسط پزشک به نحو مطلوبی انجام گیرد.

که نتیجه آن ارتقاء سطح بهداشت عمومی و از سوی دیگر اعتماد و اطمینان بیمار و پزشک به آزمایشگاه است.

انواعی از بیماریهای عفونی در انسان بوسیله ویروس ها ایجاد می شوند، برخی از این بیماریها فوق العاده کشنده بود، مثل هاری، هپاتیت، ایدز، تبهای هموراژیک و انسفالیت و برخی هم ناراحتیهای مختلفی در انسان ایجاد می‌کنند مثل سرماخوردگی، اوریون، عفونت با هر ویروس ها برخی مثل سرخچه و سیتومگالو ویروس ها ناهنجاریهای مادرزادی ایجاد می‌کنند بالاخره بعضی از ویروس ها تومور و سرطان ایجاد می‌کنند.

شیوع روز افزون بیماری های ویروس اهمیت و استفاده از روشهای پیشرفته در تشخیص این عوامل را بیش از پیش مطرح می سازد.

در سیر تکامل شعب مختلف علوم پزشکی رشته ویروس شناسی نیز مستثنی نبوده و پیوسته محققین آن در حال تکاپیو و تحقیق هستند که حاصل تجربیات آنها راهنمای ما در یافتن روشهای بهتر جهت تشخیص آزمایشگاهی بیماریهای عفونی است.

این دفتر تحت عنوان مروری بر روشهای ویروس شناسی با بررسی روشهای معمول ویروس شناسی به علاقمندان این رشته و دانشجویان علوم آزمایشگاهی و پزشکی تقدیم می‌گردد.

لازم است قید گردد این کتاب طوری طراحی شده و تنظیم شده که شخص علاقمند باید با مقدمات اولیه ویروس آشنایی داشته باشد.

تعداد صفحات 90 word

مقدمه

روشهای مختلف تشخیص آزمایشگاهی بیماریهای ویروسی برسه اصل استوار است

۱-۱ جداسازی ویروس

۱-۱- ب – جداکردن درکشت سلول

۱-۱-ج – کشت و جداکردن ویروس درحیوانات

۲-۱- تشخیص بیماریهای ویروسی توسط آزمایشهای سرمی

۳-۱- شناسایی بیماریهای ویروسی توسط آزمایشات ملکولی

تاریخچه تلقیح به تخم مرغ جنین دار

۲-۱- محاسن استفاده ازتخم مرغ جنین دار

۲-۲ منبع تهیه تخم مرغ

۳-۲ علائم رشد ویروس

۴-۲ ساختمان تخم مرغ جنین دارد

اعمال غشاء الانتوئیک شامل:

۵-۲ رشد جنین درسنین مختلف

۶-۲ راههای تزریق

۷-۲ موارد استعمال تخم مرغ جنین دار SPF درتشخیص ویروسها

الف-ویروسهائی که درتمام قسمتهای تخم مرغ جنین دار رشد می کنند.

ب-ویروسهائی که روی پرده کوریوالانتوئیک رشد کرده و ایجاد جراحات شدید می کنند.

ج-ویروسهائی که روی پرده کوریولاانتوئیک رشد کرده و ایجاد جراحات مختصر می کنند.

د-ویروسهای که درروی پرده کوریوالانتوئیک رشد کرده و ایجاد جراحت نمی‌کنند.

ه-ویروسهائی که درحفره الانتوئیک رشد می کنند.

و-ویروسهائی که درحفره آمنیوتیک رشد می کنند .

ی – ویروسهائی که درکیسه زرده رشد می کنند.

۸-۲- روشهای مختلف کشت عوامل ویروسی درتخم مرغ جنین دار SPF

مدمات تزریق

وسایل موردنیاز شامل

۹-۲ روش تزریق درحفره الانتوئیک

۱۰-۲ روش تزریق درحفره آمینوتیک

روش اول

روش دوم

روش سوم

۱۱-۲-تزریق در کیسه زرده

۱۳-۲-برداشت مایعات و غشاء های آلوده به ویروس ازتخم مرغ جنین دار تزریق شده

۳-کشت سلول Cell Culture

1-3-مقدمه ای برکشت سلول

۲-۳- موارد سودمند کشت سلول:

۳-۳-مواردی که کشت سلول با اشکال مواجه می‌شود.

۴-۳-کشت سلول اولیه Primary cell culture

5-3-جدا نمودن نسج مورد استفاده جهت کشت سلول اولیه

۶-۳-(تهیه کشت سلول اولیه به روش explant)

7-3-تهیه سلول اولیه به روش آنزیمی

۸-۳-هضم آنزیمی به روش تریپسین گرم

۹-۳-هضم آنزیمی به روش تریپسین سرد

۱۰-۳-استفاده از آنزیم های دیگر جهت هضم نسج

11-3-هضم مکانیکی

۱۲-۳-جداسازی سلولهای زنده و مرده

۱۳-۲-کشت سلول ثانویه، دیپلوئید:

۱۴-۳-هیستولوژی سلولهای دیپلوئید

۱۵-۳-خصوصیات رشد

۱۶-۳-منحنی رشد سلولهای دیپلوئید

۱۷-۳-رابطه بین ظرفیت تکثیر و مادر سلول

۱۸-۳-رابطه بین کشت سلولهای انسانی و سن(پدیده Hayflick)

19-3-کشت سلول معلق Suspension cell culcutre

۲۰-۳-روشهای کشت معلق:

۲۱-۳-روش Selection

۲۳-۳-عادت دادن یاخته به شرایط تعلیق Adaptation

23-3-شرایط لازم برای انجام یک کشت معلق سلول

24-3-خصوصیات محیط کشت سوسپانسیون:

۴ELISA -

1-4-مزیت تکنیک ELISA:

2-4-انواع روش‌های ELISA:

3-4-مراحل کار در ASILE

5-«ممانعت از هم اگلاتیناسیون»

روش آزمایش:

روش انجام آزمایش:

۵-۶-آزمایش PCR

آنزیم DNA Polymerase

داکسی نوکلئوتید تری فسفات

DNA الگو

غلظت یون منیزیم (Mg+2)

الف-اتصال پرایمر

ب-دمای تفکیک یا جداسازی DNA

ج-فعالیت آنزیم Taq DNA polymerase

 پرایمرها

بافر PCR و کمک کننده ها

سیکلهای PCR

مرحله اتصال

مرحله ساخت

تعداد سیکل

سیستم های الکتروفورز

پایان نامه آماده رشته دامپزشکی - با عنوان روشهای ویروس شناسی تخم مرغ جنین دار، کشت سلول - 109 صفحه word

مقدمه

تعداد زیادی از بیماریهای انسان، حیوان و گیاه با وجود اینکه واگیر و قابل انتقالند توسط باکتریها، قارچها، پروتزوئرها و به طور کلی توسط عواملی ایجاد می شود که نمی توان آنها را با میکروسکوپ عادی دید، و عفونی بودن اینگونه بیماریها را می‌توان با تزریق مواد آلوده ویا پالیده آنها به دامهای حساس به اثبات رسانید.

ویروسها ازجمله کوچکترین عوامل عفونی می باشند که به علت دارا بودن خصوصیات مختص خود با سایر موجودات زنده تفاوت دارند. ویروسها را نمی توان درمحیطهای مصنوعی آزمایشگاهی به راحتی تشخیص داد و بمنظور کشت، جداسازی و نهایتاَ شناسائی آنها از حیوانات حساس، تخم مرغ جنین دار و کشت سلول استفاده می شود. در اثر استفاده از تخم مرغ جنین دار برای کشت ویروسها پیشرفت قابل ملاحظه ای درراه شناسایی و جداسازی این عوامل عفونی حاصل شده است.

بیشتر ویروسها به میزبان ویژه ای اختصاص دارند به نحوی که دربدن میزبان اختصاصی نیز، بافت و یا سلولهای ویژه ای را جهت تکثیر و بقای خود انتخاب می‌کنند. با توجه به دارا بودن چنین شرایط انحصاری دراین دسته ازمیکروارگانیسمهای عفونی می توان بااستفاده از روشهای مخصوص و تکنیکهای مناسب تعداد زیادی از ویروسها را به رشد دربافت میزبان دیگر عادت داد.

نظر به اینکه یاخته ها و پرده های غشائی اطراف جنین مرغ مانند بیشتر بافتهای جنین فعالیتهای اختصاصی دقیقی ندارند رشد و تکثیر تعداد زیادی از ویروسها درآنها امکان پذیر می باشد.

تخم‌های مرغ‌های جنین دار که درمراحل گوناگون رشد می باشند با بکارگیری روشهای مختلفی می توان درآنها تلقیح نمود بعد از تلقیح تخم مرغها را درشرایط مناسب نگهداری نموده و هر روز بررسی می نمایند. روشهای استانداردی جهت تلقیح ویروسهای مختلف به غشاء کوریوآلانتوئیک، کیسه آمنیوتیک، کیسه آلانتوئیک، کیسه زرده یا جنین، داخل مغز جنین و داخل عضلانی موجود است. مایع یا بافتهای آنها را پس مدت زمان برداشته و تکثیر ویروس یا آسیب‌های ناشی از آن رابررسی می‌کنند.

واکنش بین ویروس ومیزبان خیلی اختصاصی بوده و از نظر بیولوژی ویروسها، بازتاب تنوع سلولهای میزبان آنها می باشد. تنوع دربین ویروسها به روشهای گوناگونی که ویروسها برای تکثیر و باقی ماندن ازخود نشان می دهند بستگی دارد.

درزمینه کشت ویروسها نیز قدمهای مهم و با ارزشی برداشته شده است تلقیح به تخم مرغ یا استفاده از کشت سلول که به ترتیب توسط ودروف (Woodruff) و پارکر (Parker) انجام پذیرفت ازمفیدترین روشهاست که برای رشد ویروسها به کاررفته است و درحال حاضر در آزمایشگاههای ویروس شناسی مورد استفاده می باشد پیشرفتهایی که درزمینه علوم بیوفیزیک، بیوشیمی، ایمنی شناسی و ژنتیک حاصل شده، به شناخت ماهیت ویروسها کمک قابل توجهی کرده است. استفاده از دستگاههایی نظیر میکروسکوپ الکترونی، اولتراسانتریفوژ، میکروسکوپ فلورسنت و اولترافیلتر درپیشبرد ویروس شناسی بسیار موثربوده است.

روشهای مختلف تشخیص آزمایشگاهی بیماریهای ویروسی برسه اصل استوار است  جداسازی ویروسروشهای سرمیروشهای ملکولی

1-1 جداسازی ویروس

برای کشت و جداکردن ویروسها معمولاً ازحیوانات حساس، تخم مرغ جنین دار ویا کشت سلول استفاده می شود. نمونه های مایع را که عاری از باکتری باشند می توان مستقیماً و یا پس از رقیق کردن به محیط زنده تلقیح نمود. نمونه های جامد را باید درمحلول تامپون به نسبت 20-10 درصد به صورت تعلیق درآورد. سپس توسط سانتریفوژبا دورکم ذرات معلق راجدا ساخت و مایع را دوباره سانتریفوژ کرده  و سپس اقدام به کشت نمود.

1- ا- الف-کشت درتخم مرغ جنین دار

دراثر استفاده از تخم مرغ جنین دار برای کشت ویروسها پیشرفت قابل ملاحظه ای درراه شناسایی و جداسازی این عوامل بوجود آمده است. نظر به اینکه بافت ها و پرده های غشایی اطراف جنین مرغ مانند بیشتر بافتهای جنین فعالیتهای اختصاصی دقیقی ندارند، رشد تعداد زیادی از ویروسها درآنها امکان پذیر می باشد.

1-1- ب - جداکردن درکشت سلول

پیشرفتهای حاصل درکشت سلول وسیله با ارزشی برای جداسازی و تکثیر ویروسها در اختیار ویروس شناسان قرارداده است. ازدیاد ویروس درکشت سلول را می توان به روشهای مختلف ازقبیل اثر بیماری زائی درسلول(CPE) تداخل ویروسها(Interference)، جذب گلبولهای قرمز به یاخته های حاوی ویروس (Hemadsorption) هماگلوتنیشن(HA)، جستجوی آنتی ژن توسط ایمونوفلورسنت و یا ثبوت مکمل (CFT) تشخیص داد.

1-1-ج - کشت و جداکردن ویروس درحیوانات

انتخاب حیوان حساس برای جداکردن ویروس نکته اصلی دراین روش است که دراین رابطه فاکتورهای ضروری زیررا می بایست درنظر گرفت.

1-سن حیوان

2-میزبان طبیعی ویروس

3-منشأ حیوان

درحال حاضر ازاین روش به ندرت استفاده می شود و بیشتر دربررسیهای ویروس شناسی کاربرد دارد.

2-1- تشخیص بیماریهای ویروسی توسط آزمایشهای سرمی