پروژه آماده: ارزیابی میزان تولید داروی دسفرال از سویه استرپتومایسس پیلوسوس به روش بیولوژیک (167 صفحه فایل ورد - Word)

چکیده 

دسفری اکسامینB،‌ تنها سیدروفوری است که فرم مزتیله آن (نمک متان سولفونات دسفری اکسامین B) با نام تجاری دسفرال جهت درمان بیماران تالاسمی، به منظور شلاته کردن بار اضافی آهن، استفاده می گردد.

به همین منظور جهت تولید دسفری اکسامین B، از سویه استرپتومایسس پیلوسوس استفاده گردید و سویه مربوطه در محیط کشت Soy bean کشت داده شد و دسفری اکسامین آن بوسیله استفاده از محلول فنل- کلروفرم و اتر استخراج گردید. به منظور طراحی این سیستم بیولوژیکی و افزایش بهره برداری از محصول مذکور از منابع کربن و نیتروژن مختلف استفاده گردید و تاثیر هر یک بر میزان دسفری اکسامین تولیدی بررسی شد. چنانچه مشاهده گردید که اسید آمینه ترئونین، افزایش قابل ملاحظه ای بر دسفری اکسامین تولیدی از سویه مذکور دارد و مقدار %125/0 ترئونین، در محیط کشت Soy bean، بسیار مطلوب می باشد. از طرفی اثر ویتامین تیامین (B1)بررسی گردید و مشاهده شد که تاثیر مثبت بر دسفر اکسامین تولیدی دارد و در رده بعد از اسید آمینه ترئونین قرار می گیرد. همچنین اثر اسید آمینه لوسین نیز بر تولید دسفری اکسامین مثبت بوده و در رده بعد از ویتامین تیامین (B1) قرار می گیرد.

در ایـن تحقـیق از شلاته کننـده های کاتیونی EDTA، 8-hydroxyquinoline  در محـیط کشت Soy bean استفاده شد و مشاهده گردید که شلاته کننده های مذکور اثر منفی بر تولید دسفری اکسامین  دارند در نتیجه، کاتیونها، اثر مثبت بر افزایش میزان دسفری اکسامین تولیدی خواهند داشت به همین منظور مواد معدنی مختلف از جمله اثر

CaCl2.2H2O,MgSO4.7H2O,ZnSO4.7H2O, MnCl2, FeSO4.7H2O

و همچنین  اثرCaCl2.2H2O,MgSO4.7H2O به طور همزمان در محیط کشت Soy bean بررسی گردید.

در این تحقیق نتایج مطلوبی بدست آمد، بطوری که کلسیم (بصورت CaCl2.2H2O) اثر قابل ملاحظه‌ای بر افزایش میزان دسفری اکسامین تولیدی از سویه مذکور دارد و مقدار 8/2، و 2، CaCl2.2H2O سبب افزایش قابل توجهی بر میزان محصول مذکور می گردد. و بدین ترتیب تاثیر مثبت کلسیم، بر تولید دسفری اکسامین مشخص گردید.

در این آزمایشات تاثیر مثبت روی، منیزیم و منگنز بر دسفری اکسامین تولیدی آشکار گردید بطوری که غلظت  2-10 × 4/0، ZnSO4.7H2O و  6/0، MgSO4.7H2O و  2، MnCl2 سبب افزایش تولید دسفری اکسامین شد.

از طرفی استفاده همزمان CaCl2.2H2O,MgSO4.7H2O در محیط کشت Soy bean اثر منفی بر تولید دسفری اکسامین را نشان داد.

همچنین بررسی ها در مورد آهن (بصورت FeSO4.7H2O)‌ نشان داد که افزایش غلظت آهن، سبب کاهش میزان دسفری اکسامین تولیدی گردید.

و اینگونه با استفاده از منابع نیتروژن و مواد معدنی مختلف بهینه سازی محیط کشت انجام گرفت و تولید دسفری اکسامین از سویه استرپتومایسس پیلوسوس به میزان قابل ملاحظه ای افزایش یافت.

در این تحقیق، پروتئاز تولیدی از سویه استرپتومایسس پیلوسوس نیز بوسیله روش لوری (Lowry) اندازه گیری شد و اثر روی بصورت ZnSO4.7H2Oو آهن بصورت FeSO4.7H2O نیز بررسی گردید و مشاهده شد که افزایش غلظت روی، سبب افزایش پروتئاز تولیدی، از سویه مذکور گردید.

فهرست مطالب

 عنوان صفحه

چکیده1

مقدمه3

فصل اول

1-1 - تالاسمی8

1-2-اتیولوژی و سبب شناسی تالاسمی8

1-2-1 - خون شناسی9

1-2-2- خون سازی و گلبولهای قرمز10

1-3- تالاسمی و انواع آن10

1-3-1 آلفا تالاسمی10

1-3-2- بتا تالاسمی11

1-3-2-1 بتا تالاسمی مینور(سالم ناقل)11

1-3-2-2 – بتا تالاسمی ماژور( بیماری تالاسمی)12

1-3-2-3-بتا تالاسمی بینابینی13

1-4- تشخیص تالاسمی13

1-5- درمان تالاسمی13

1-6- فیزیولوژی عنصر آهن و اهمیت آن در بدن انسان14

1-6-1- مسمومیت حاد آهنی15

1-7- دسفرال16

1-7-1- نحوه استفاده از داروی دسفرال17

1-7-2-کاربردهای داروی دسفرال در پزشکی18

1-7-3- عوارض ناشی از داروی دسفرال19

1-7-4- اقدامات احتیاطی در مورد داروی دسفرال19

1-7-5- ملاک توقف درمان بوسیله دسفرال20

فصل دوم

2-1-  سیدرو فورها22

2-1-1- هیدروکسامات ها24

2-1-2-فنولات ها یا کاتکولات ها25

2-2- دسفری اکسامین ها26

2- 2-1 – ساختمان دسفری اکسامین28

2-2-2- دسفراکسامین بصورت آنتی اکسیدان28

2-2-3 – خصوصیات فیزیکو و شیمیایی دسفراکسامین29

2-2-4- مکانیسم دسفراکسامین در جلوگیری از بیماریهای با بار اضافی آهن29

2-2-5- تشکیل رادیکال  DFO nitroxide30

2-3-  دسفری اکسامین B31

2-3-1- بیوسنتر دسفری اکسامین B33

2-3-2- ژنهای کد کننده دسفری اکسامین B33

2-4- تولید کننده­های دسفری اکسامین34

2-5- اهمیت آهن بر روی میکروارگانیسمها35

2-6- مکانیسم عمل سیدروفورها در ارتباط با انتقال آهن به درون سلول میکروارگانیسمها36

2-7- تولید، استخراج و تخلیص دسفری اکسامین B37

فصل سوم

3-1- اکتینومیست ها40

3-2- استرپتومایسس ها43

3-2-1- پاتولوژی43

3-2-2 – مرفولوژی و ساختمان43

3-2-3- مشخصات کلنی454

3-2-4- اسپورزایی47

3-2-5- ترکیبات پوشش سلولی49

3-2-6- تغذیه و فاکتورهای موثر بر رشد و خصوصیات فیزیکوشیمیایی49

3-2-6-1- تغذیه49

3-2-6-2- اکسیژن50

3-2-6-3 - رطوبت50

3-2-6-4- دما51

3-2-6-5- pH51

3-2-6-6- اکولوژی52

3-2-6-7- بیولوژی توسعه یافته استرپتومایسس53

3-2-7- انواع فرآورده های میکروبی56

3-2-7-1- متابولیت های اولیه56

3-2-7-2- متابولیت های ثانویه56

3-2-7-2-1- آنتی بیوتیک ها58

3-2-7-2-1-1- فیزیولوژی و تنظیم تولید آنتی بیوتیک58

3-2-7-3- آنزیمها63

3-2-7-3-1- پروتئازها63

3-2-7-3-1-1- پروتئازهای اسیدی67

3-2-7-3-1-1-1- رنین67

3-2-7-3-1-2- پروتئازهای خنثی67

3-2-7-3-1-3- پروتئاز های قلیایی67

3-2-7-3-1-3-1- فرآیند تخمیر پروتئازهای قلیایی68

3-2-7-3-1-3-2- تعیین فعالیت پروتئاز قلیایی69

3-2-7-3-1-4- بازدارنده های فعالیت آنزیم پروتئاز وشلاته کننده ها69

3-2-7-3-1-5- تجزیه71

3-2-7-3-1-6- پروتئاز ها و استرپتومایسسها71

3-2-8- محیط کشت  تخمیر صنعتی71

3-2-8-1- نیازهای غذایی میکروارگانیسم‌ها71

3-2-8-1-1- کربن74

3-2-8-1-1-1- منابع کربن و استرپتومایسس ها77

3-2-8-1-2-نیتروژن78

3-2-8-1-2-1-  منابع نیتروژن و استرپتومایسس ها80

3-2-8-1-3- هیدروژن و اکسیژن80

3-2-8-1-4- مواد معدنی80

3-2-8-2-تنظیم کننده های متابولیکی81

3-2-8-3- ضد کف ها82

3-2-9- بیوسنتز  در استرپتومایسس ها83

فصل چهارم

4-1- دستگاه های مورد استفاده86

4-2- وسایل مورد استفاده86

4-3 - محیط های کشت مایع برای رشد باکتری88

4-4- محیط های کشت جامد برای رشد باکتری89

4-5- محیط های جامد برای تولید اسپور89

4-6- مواد لازم جهت رنگ آمیزی گرم90

4-7- مواد لازم جهت استفاده از میکروسکوپ نوری91

4-8- محیط مورد استفاده جهت شناسایی کیفی دسفری اکسامین: محیط Des491

4-9- محیط مورد استفاده جهت اندازه گیری تولید دسفری اکسامین محیط Soy bean 91

4-10- مواد لازم جهت نگهداری و ذخیره باکتری ها92

4-11- معرف های دسفری اکسامین92

4-12- مواد لازم جهت رسم منحنی استاندارد دسفری اکسامین B92

4-13- مواد لازم جهت استخراج دسفری اکسامین92

4-14- مواد لازم جهت تهیه محلول Lysing Buffer93

4-14-1 – مواد لازم جهت تهیه محلول Tris Hcl93

4-15- محلول کازئین %5/0 دربافر فسفات93

4-15-1- بافر فسفات (PBS)93

4-16- محلول لوری (Lowry)93

فصل پنجم

5 – ١- تهیه و آماده سازی سویه استرپتومایسس پیلوسوس98

5 ـ ٢ ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیکی سویه استرپتومایسس پیلوسوس98

5-٢-١- خصوصیات ماکروسکوپی99

5- ٢-١-١- کشت استرپتومایسس پیلوسوس بر روی محیط جامد99

5-٢-١-٢- کشت استرپتومایسس پیلوسوس در محیط مایع99

5-٢-٢ خصوصیات میکروسکوپی99

5-٢-٢-١- تهیه لام از محیط کشت جامد99

5-٢-٢-٢- تهیه لام از محیط کشت مایع100

5ـ ٢ـ٢ـ ٣ـ رنگ آمیزی گرم100

5 ـ ٣ـ تهیه مایع تلقیح100

5 ـ ٣ـ ١ـ تهیه محیط ذخیره101

5 ـ ٣ـ ٢ـ تهیه سوسپانسیون اسپور101

5ـ ٤ـ رسم منحنی رشد استرپتومایسس پیلوسوس101

5ـ ٥ـ بررسی تغییرات  pH در محیط کشت Soybean102

5ـ ٦ـ تولید دسفری اکسامین توسط استرپتومایسس پیلوسوس102

5ـ ٦ـ ١ـ تشخیص کیفی دسفری اکسامین102

5ـ ٦ـ ٢ـ سنجش میزان تولید دسفری اکسامین در هر روز103

5-6-3- رسم منحنی استاندارد دسفرال103

5-٧ـ استخراج دسفری اکسامین بوسیله فنل-کلروفرم104

 5 ـ ٧ـ ١ـ مزتیله کردن دسفری اکسامین105

5-8- تعیین وجود دسفری اکسامین B در ماده استخراج شده105

5ـ ٩ـ  بهینه سازی محیط کشت تولید دسفری اکسامین107

5ـ ٩ـ ١ـ بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین107

5 ـ ٩ـ ١ـ ١ـ بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین در یک محدوده غلظت107

5ـ ٩ـ ٢ـ بررسی اثر اسیدآمینه ترئونین و اسید آمینه لوسین و ویتامین تیامینB1)  ( برتولید دسفری اکسامین 108

5 ـ ٩ـ ٣ـ بررسی گلوکز و ملاس و سوکروز بر تولید دسفری اکسامین108

5ـ ٩ـ ٤ـ بررسی اثر شلاته کننده های کاتیون بر تولید دسفری اکسامین108

5 ـ ٩ـ ٥ـ  استفاده از محیط کشت عصاره مخمر به جای استفاده از محیط کشت Soybean109

5 ـ ٩ـ ٦ـ بررسی اثر مواد معدنی مختلف بر میزان تولید دسفری اکسامین109

5 ـ٩ـ٦ـ١ـ بررسی تاثیر مواد معدنی در غلظت های مختلف بر میزان تولید دسفری اکسامین111

5 ـ ١٠ - بررسی پروتئاز تولیدی از استرپتومایسس پیلوسوس در حضور شلاته  کننده ها و مواد معدنی مختلف112

5 ـ ١٠ـ ١ـ کشت باکتری و سنجش پروتئاز112

5 ـ ١٠ـ 2ـ تخلیص کازئین113

فصل ششم

6ـ ١ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیکی ماکروسکوپی استرپتومایسس پیلوسوس115

6ـ ١ـ ١­ـ خصوصیات ماکروسکوپی سویه استاندارد بر روی محیط کشت جامد115

6 ـ ١ـ٢ـ خصوصیات ماکروسکوپی سویه استاندارد در محیط کشت مایع115

6 ـ ٢ـ بررسی خصوصیات مرفولوژیکی میکروسکوپی استرپتومایسس پیلوسوس116

6 ـ٣ـ رسم منحنی رشد استرپتوماسیس پیلوسوس در محیط کشت MYB116

6-4- رسم منحنی pH بر حسب زمان در محیط کشت Soybean حاوی سویه استرپتومایسس پیلوسس118

6 ـ ٥ـ تشخیص کیفی و کمی دسفری اکسامین تولیدی120

6-5-1- تشخیص کیفی و تولید و یا عدم تولید دسفری اکسامین120

6ـ٥ـ2ـ رسم نمودار استاندارد دسفرال120

6ـ٥ـ3ـ میزان دسفری اکسامین تولیدی در هر روز توسط سویه استرپتومایسس پیلوسوس در محیط Soy bean121

6-6- نتایج مربوط به استخراج دسفری اکسامین تولید شده توسط سویه استرپتومایسس پیلوسوس122

6-6-1- نتایج مربوط به تأیید وجود دسفری اکسامین B در ماده استخراج شده122

6-7-  بهینه سازی محیط کشت تولید دسفری اکسامین124

6-7-1  بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین124

6-7-1-1- بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین در یک محدوده غلظت124

6ـ7ـ ٢ـ بررسی اثر اسید آمینه های ترئونین و لوسین و ویتامین تیامین (B1 )126

6 ـ 7ـ٣ـ بررسی گلوکز ، ملاس، سوکروز بر تولید دسفری اکسامین126

6ـ 7ـ ٤ـ بررسی اثر شلاته کننده های کاتیون بر میزان تولید دسفری اکسامین127

6ـ 7ـ ٥ـ استفاده از محیط کشت عصاره مخمر به جای استفاده از محیط کشت Soybean128

6 ـ 7ـ ٦ـ بررسی اثر مواد معدنی مختلف بر میزان تولید دسفری اکسامین128

6 – 7 – 6 – 1 – بررسی اثر مواد مختلف با غلظت متفاوت بر میزان تولید دسفری اکسامین 130

6ـ8ـ بررسی پروتئاز تولیدی از استرپتومایسس پیلوسوس در حضور شلاته‌کننده و مواد معدنی مختلف139

فصل هفتم

- بحث و نتیجه گیری143

- پیشنهادات147

- فهرست منابع149